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化學(xué)發(fā)光試劑的配置 在使用前等量混合A液和B液，混合后盡快使用。將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。蛋白信號(hào)顯現(xiàn)用平頭鑷鉗住膜片，垂直置于吸水紙以吸去過(guò)量試劑。置膜片于二層保鮮膜之間，小心趕盡氣泡。將膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中。于暗室中壓上X光片。根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min或5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)zui佳效果。顯影沖洗。調(diào)節(jié)曝光時(shí)間，再次曝光顯影。
化學(xué)發(fā)光試劑本試劑是非放射性發(fā)光系統(tǒng)，用于檢測(cè)固定在膜上的蛋白，其敏感性達(dá)1-5pg。用X光片可快速地獲得*的硬拷貝結(jié)果。所含獨(dú)特的底物足以維持12小時(shí)以上的發(fā)光，便于反復(fù)曝光操作，免疫印跡膜經(jīng)抗體脫卸處理后可供再次抗體探查使用。適用于痕量蛋白或核酸檢測(cè)。
化學(xué)發(fā)光試劑原理：辣根過(guò)氧化酶使試劑中的發(fā)光物（Luminol）氧化并發(fā)光，而試劑中含有增強(qiáng)劑這使得發(fā)光增強(qiáng)了1000倍。在免疫印跡中，將復(fù)雜的蛋白混合物經(jīng)SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到固相膜上（如NC、PVDF）等，用于免疫學(xué)檢測(cè)，經(jīng)HRP標(biāo)記的抗體與膜上的蛋白直接（標(biāo)記一抗）或間接（標(biāo)記二抗）反應(yīng)。當(dāng)加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑后，Luminol發(fā)生氧化降解，并發(fā)射波長(zhǎng)為428nm的光，此光可經(jīng)X光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來(lái)。
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