目前，為了滿足臨床診斷和群體血清學(xué)篩查的需要，國內(nèi)外已有大量SARS-CoV-2抗體的商業(yè)化檢測試劑盒上市或正在研發(fā)中。由于許多檢測方法因為緊急情況授權(quán)而快速通過監(jiān)管審查批準(zhǔn)上市，發(fā)表的相關(guān)臨床和基礎(chǔ)研究雖然逐漸增加，但抗體檢測結(jié)果受檢測方法、檢測試劑、疾病嚴(yán)重程度以及病程等因素影響較大，因此一些發(fā)表的研究結(jié)果差異較大。為了更好的評估SARS-CoV-2抗體檢測的診斷價值，優(yōu)化其在臨床中的應(yīng)用，本文結(jié)合國內(nèi)外最新研究進(jìn)展，總結(jié)了抗體檢測的方法學(xué)原理、準(zhǔn)確性和局限性，以幫助臨床更好的進(jìn)行結(jié)果解釋和診治。

一、SARS-CoV-2抗體檢測的方法學(xué)比較和性能差異分析

截至2021年1月5日，F(xiàn)IND網(wǎng)站上已登記了567種已獲批上市或正在研發(fā)中的SARS-CoV-2免疫學(xué)檢測方法，其中主要包括以下幾種檢測方法：酶聯(lián)免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、膠體金免疫層析分析（gold immunochromatography assay，GICA），和血清病毒中和試驗（serum virus neutralization，SVN）等。以上各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，不同研究給出的敏感性和特異性數(shù)據(jù)差異較大，除了與試劑盒性能有關(guān)，也受入組人群特征、患者發(fā)病時間等因素的影響。

ELISA、CLIA和GICA的檢測原理類似，敏感性較好，操作相對簡單，對實(shí)驗室、設(shè)備及要求素質(zhì)的要求低于核酸檢測，但影響因素較多，易產(chǎn)生陰性結(jié)果，且難以在感染早期檢測出陽性，且特異性相對較差，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，檢測靈敏度和特異性均低于核酸PCR技術(shù)。

GICA方法操作簡單、快速，使用標(biāo)本量小，僅需10-15μl血液樣本，約15分鐘內(nèi)即可通過肉眼觀察獲得結(jié)果，不需要大型儀器設(shè)備，對操作流程和實(shí)驗室環(huán)境要求不高，也被用作床旁檢測（point of care testing，POCT）和流行病學(xué)監(jiān)測的重要手段。通常是將受試者血液滴加在測試條加樣區(qū)，如果血液里含有SARS-CoV-2抗體，則會與膠體金標(biāo)記的重組病毒抗原或純化抗人單克隆抗體結(jié)合，在側(cè)向?qū)游龅倪^程中，在檢測線上與單克隆抗體或重組抗原結(jié)合從而呈現(xiàn)陽性條帶。但是條帶的判讀經(jīng)常具有主觀性，一些很弱的條帶結(jié)果判讀比較困難，有研究發(fā)現(xiàn)某廠家試劑弱條帶的比例占比達(dá)37%（11/29）。

目前獲得國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的生產(chǎn)廠家有北京新興四寰、珠海麗珠、上海芯超、廣州萬孚、英諾特（唐山）、南京諾唯贊、廣東和信，與GICA類似的免疫層析方法還有北京金豪制藥股份有限公司研發(fā)的量子點(diǎn)熒光免疫層析法、廈門奧德生物科技有限公司的稀土納米熒光免疫層析法、北京熱景生物技術(shù)股份有限公司的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法。GICA方法靈敏度較差，無法定量檢測，但是對實(shí)驗室和人員要求較低，適宜在各種國模實(shí)驗室開展，尤其適合缺乏硬件條件的小實(shí)驗室。

ELISA方法是將純化的靶抗原固定在多孔板表面作為捕獲抗原。血清樣本與該抗原孵育，使SARS-CoV-2抗體-抗原結(jié)合。標(biāo)記的二抗結(jié)合物(如辣根過氧化物酶)與SARS-CoV-2抗體結(jié)合，洗脫后添加底物和反應(yīng)中止液，繼而進(jìn)行檢測。國內(nèi)上市的ELISA方法有北京華大吉比愛研發(fā)的IgM/IgG抗體檢測試劑盒。ELISA方法特性性較強(qiáng)，對設(shè)備要求低，在具有相應(yīng)技術(shù)的各種規(guī)模實(shí)驗室均可開展，但因需要酶的結(jié)合所以需要較長時間的孵育，因此檢測試劑長，且單次檢測通量有限，操作環(huán)境開放，易污染，通常只能定性或半定量檢測。

CLIA的原理與ELISA相似，但由于其孵育期較短，不需要加反應(yīng)中止液，因此測試更簡單快速，并可提供較大的檢測通量。目前已獲批的CLIA試劑包括廈門萬泰凱瑞、博奧賽斯（重慶）、博奧賽斯（天津）、深圳市亞輝龍、鄭州安圖、丹娜（天津），檢測原理為磁微粒化學(xué)發(fā)光法，另外還包括邁克生物的直接化學(xué)發(fā)光法檢測平臺。CLIA方法特異性強(qiáng)，能夠?qū)ARS-CoV-2抗體水平進(jìn)行定量檢測，但需要特殊的設(shè)備，檢測成本相對較高，適宜在具有一定規(guī)模、有化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的實(shí)驗室開展。

SVN是一種血清學(xué)試驗，分析患者抗體中和SARS-CoV-2傳染性和減輕感染的能力。雖然臨床資料有限，但一些研究表明恢復(fù)期血漿可抑制SARS-CoV-2病毒復(fù)制，保護(hù)個體不受感染。該試驗被認(rèn)為是評估保護(hù)性抗體最可靠的方法，可以為使用恢復(fù)期血漿作為被動抗體治療感染提供參考，尤其是在重癥患者中。SVN中經(jīng)常使用的細(xì)胞系有Vero細(xì)胞（猴腎細(xì)胞系）、Huh7細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞系）、293T細(xì)胞（人腎細(xì)胞系）等。SVN方法是將連續(xù)稀釋的患者恢復(fù)期血清、活SARS-CoV-2病毒或假病毒混合孵育后，加入易感細(xì)胞混合培養(yǎng)，然后通過顯微鏡 (10, 12)或熒光觀察(11)細(xì)胞病變效應(yīng)，中和抗體滴度是指降低SARS-CoV-2活性的最高稀釋血清倍數(shù)。SVN檢測重復(fù)性高，檢測時如果使用活的SARS-CoV-2病毒，則需要在生物安全3級實(shí)驗室進(jìn)行，這限制了該方法的普及。有研究團(tuán)隊已建立了以SARS-CoV-2假病毒株為基礎(chǔ)的中和抗體檢測方法，在提高實(shí)驗操作安全性的同時，保證了檢測質(zhì)量。SVN因為操作復(fù)雜、操作時間長而未用于臨床常規(guī)診斷，如果能在常用的血清學(xué)檢測方法與SVN方法之間發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，能用簡單易行的方法分析血漿的中和抗體滴度，則會對COVID-19患者的治療發(fā)揮重要的作用。

二、抗體檢測的敏感性和特異性評價

新型冠狀病毒抗體檢測的結(jié)果可以應(yīng)用于以下四方面：1）推測感染狀態(tài)；2）確定之前的SARS-CoV-2暴露史；3）用于識別康復(fù)患者，從而進(jìn)行恢復(fù)期患者血清或血漿中和抗體檢測，作為危重癥患者的治療；4）用于監(jiān)測疫苗接種的效果。目前發(fā)表的數(shù)據(jù)表明，抗體檢測的敏感性受檢測方法、采樣時間、疾病的嚴(yán)重程度等因素影響較大，目前已上市的試劑盒需要在臨床中增加樣本量進(jìn)行準(zhǔn)確性的持續(xù)性評估。不同的檢測方法敏感性和特異性不同。如一項研究發(fā)現(xiàn)ELISA方法檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體的陽性率分別為90.4%和77.9%，特異性均為100%。發(fā)病5.5天后，IgM檢測陽性率高于核酸檢測。IgM聯(lián)合PCR檢測的陽性率為98.6%，明顯高于單獨(dú)qPCR檢測（51.9%）。也有研究者采用CLIA分析了抗體檢測的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)血清IgM和IgG抗體的檢測敏感性分別為48.1%和88.9%，特異性分別為100%和90.9%，出現(xiàn)癥狀2周后抗體檢測敏感性最高。有研究采用GICA方法對397份SARS-CoV-2感染者和128份未感染者的血液樣本進(jìn)行IgM/IgG檢測，敏感性為88.66%，特異性為90.63%。一項薈萃分析顯示，ELISA和CLIA檢測IgM或IgG抗體的綜合敏感性在90-94%之間，側(cè)向免疫分析（lateralflow immunoassay， LFIA）和熒光免疫檢測（fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA）的敏感性在80-89%之間，特異性為95%，ELISA和LFIA的特異性均大于99%。另一項薈萃分析結(jié)果顯示，ELISA檢測IgM或IgG抗體的綜合敏感性是84.3%[95% 置信區(qū)間（Confidence interval，CI）75.6-90.9%]，LFIA是66.0%（95% CI 49.3-79.3%），CLIA是97.8%（95% CI 46.2-100%），綜合特異性為96.6-99.7%。但也有研究發(fā)現(xiàn)ELISA方法的檢測敏感性低于GICA和CLIA。Mekonnen等最近發(fā)表的薈萃分析表明，CLIA、ELISA和LFIA的敏感性和特異性分別為92%（95% CI 86-95%）和99%（95%CI 97-99%）、86%（95%CI 82-89%）和99%（95%CI98-100%），和78%（95%CI 71-83%）和98%（95% CI 96-99%）。

（一）新型冠狀病毒感染抗體產(chǎn)生的血清轉(zhuǎn)換和動態(tài)變化

1.抗體的動態(tài)變化：國家衛(wèi)生健康委員會公布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第八版）》中指出發(fā)病1周內(nèi)抗體陽性率較低，多個研究也證實(shí)了隨著發(fā)病時間的延長，抗體陽性率也明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)，ELISA方法檢測的IgM抗體滴度在第2周開始明顯升高，在之后的第三周和第四周保持穩(wěn)定，IgA抗體滴度的動態(tài)變化與IgM相似。IgG抗體滴度水平從第1周開始持續(xù)增加，到第21天時達(dá)到平臺期，之后持續(xù)存在。因此，基于抗體的動態(tài)變化可能確定感染階段和評估疾病流行病學(xué)。Chen等進(jìn)行的多中心回顧性研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病1周內(nèi)的血清抗體陽性率為26-39%，第2周升高到59-74%，第3周為77-89%，21天后敏感性均大于90%，特異性均大于95%。另一項薈萃分析結(jié)果顯示，出現(xiàn)癥狀后1周內(nèi)抗體的敏感性是13.4-50.3%，而3周后則上升到69.9-98.9%。一項Cochrane綜述分析發(fā)現(xiàn)，IgG和IgM聯(lián)合檢測在疾病發(fā)作后第1周的敏感性是30.1%，第2周為72.2%，第3周達(dá)到91.4%，特異性大于98%。而且隨著發(fā)病時間的延長，抗體幾何平均滴度也從第一周的400升高到第2周的535.8，而第3周后保持穩(wěn)定。一項研究評估了3種ELISA方法、2種CLIA、1種電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrical chemiluminescent immunoassay，ECLIA）和6種LFIA的敏感性，12種檢測方法在第1周的敏感性均較低（40-60%），3周后敏感性均提高到80%-100%的水平。LFIA方法在14天后的敏感性均大于75%，21天后達(dá)到90%以上，IgM、IgG試劑的特異性均大于95%。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2感染者的保護(hù)性免疫反應(yīng)在感染后2-3個月開始下降，特別是IgG和中和抗體水平。而SVN檢測在早期的敏感性可能高于其他方法， 一項采用SVN的研究發(fā)現(xiàn)，感染10天后抗體陽性率達(dá)到100%，總體幾何平均滴度為1:163.7。

2. 靶抗原和抗體類型：抗體檢測的敏感性與試劑中使用的檢測抗原有關(guān)，檢測系統(tǒng)中靶抗原主要包括核蛋白（Nucleocapsid Protein，N）、刺突蛋白（Spike Protein，S）、S1亞基和受體結(jié)合區(qū)域（receptor-binding domain，RBD）。

研究發(fā)現(xiàn)，抗N蛋白IgG抗體升高早于抗S蛋白IgG抗體，而下降也早于后者(25)。相應(yīng)的，與N蛋白相比，S蛋白作為抗原檢測的敏感性較低，而特異性較高，尤其是S1亞基。一些研究表明，S蛋白比N蛋白更具免疫原性或傾向于引起更大的免疫反應(yīng)，因為它能夠促進(jìn)中和抗體的產(chǎn)生。因此推薦根據(jù)感染病程的不同選擇針對不同抗原的檢測方法。對于血清流行病學(xué)研究，則推薦針對S蛋白的檢測。而且抗S蛋白IgG抗體的滴度水平可能更好地反映對人體再感染的保護(hù)作用。

一項薈萃分析發(fā)現(xiàn)CLIA-RBD檢測的敏感性高達(dá)96%，而LFIA-S的敏感性較低，為71%（95 %CI：58-80%）。研究發(fā)現(xiàn)基于RBD抗原的抗體檢測的特異性可達(dá)90%，S1抗原對非SARS-CoV冠狀病毒的特異性為100%，與MERS-CoV的交叉反應(yīng)方面優(yōu)于S抗原，特異性更強(qiáng)?；贜蛋白的抗體檢測發(fā)現(xiàn)了與MERS-CoV的交叉反應(yīng)。因此認(rèn)為RBD和S1比S和N抗原更為特異。

3.抗體檢測的轉(zhuǎn)陽時間：研究發(fā)現(xiàn)PCR的轉(zhuǎn)陽時間是從出現(xiàn)癥狀后的第5.3天（0-19天），而血清學(xué)測定的缺點(diǎn)之一是早期階段敏感性較低。有研究發(fā)現(xiàn)，感染SARS-CoV-2后第一周開始產(chǎn)生IgM和IgG，通常在第二周可檢測到。因此在進(jìn)展期和恢復(fù)期取樣更有效。不同研究中報道的抗SARS-CoV-2抗體轉(zhuǎn)為陽性的時間可能略有差異。在一項由82名確診病例和58名疑似病例的研究中， IgM在發(fā)病后第5天（中位數(shù)）可以檢測到，IgG則在第14天（中位數(shù)）可以檢測到；在一項研究中，IgM和IgG的中位血清轉(zhuǎn)陽時間分別為第12天和第14天(27)；另一項研究發(fā)現(xiàn)，IgG的轉(zhuǎn)陽時間可能早于IgM和總抗體，中位數(shù)分別為4、12、11天，并且總抗體的高滴度與疾病的嚴(yán)重程度分型具有獨(dú)立相關(guān)性。

（二）新型冠狀病毒抗體與患者預(yù)后和疾病程度的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，抗SARS-CoV-2 S蛋白和N蛋白的IgG和IgM水平與病毒中和效價相關(guān)，抗體效價越高，臨床分型越差，這表明抗體滴度在評估患者預(yù)后和恢復(fù)方面具有潛在價值。另一項研究也表明，中度或重型患者的中和抗體滴度略高于輕度感染者的抗體滴度。

（三）人群的血清抗體流行率

相對于PCR技術(shù)，血清學(xué)抗體檢測操作簡單，更適合人群流行病學(xué)的調(diào)查分析。全球不同區(qū)域報道的人群血清流行率范圍在0.1-20%之間，并隨著時間的推移而增加，不同的國家或地區(qū)，研究人群、疾病流行階段以及血清學(xué)檢測方法不同而有較大差異，因此為建立COVID-19的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，應(yīng)定期在各地點(diǎn)展開動態(tài)血清流行病學(xué)監(jiān)測。

（四）新型冠狀病毒抗體檢測的局限型

SARS-CoV-2抗體結(jié)果可能因發(fā)病時間、檢測方法性能而不同。目前尚不清楚IgM或IgG抗體在感染期間何時可被檢測到，感染后抗體能持續(xù)多長時間，中和抗體對后續(xù)病毒感染的保護(hù)程度如何，研究的敏感性和特異性結(jié)果也提示該檢測方法存在假陰性和假陽性的可能性。

1.假陰性：血清學(xué)抗體檢測有窗口期，IgA和IgM通常持續(xù)時間較短，后期可能產(chǎn)生IgG，在不適宜的階段采樣可能會導(dǎo)致假陰性。同時個體免疫反應(yīng)和抗體產(chǎn)生能力的差異也可能導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。在疾病早期抗體分泌不足、重癥患者、免疫功能缺陷或低下的患者可能無法產(chǎn)生抗體應(yīng)答。因此，建議在不同時間點(diǎn)進(jìn)行多次動態(tài)血清學(xué)檢測，另外與單純IgM或IgG檢測相比，IgM和IgG聯(lián)合檢測可以更有效的降低假陰性發(fā)生。

2.假陽性：在低流行率人群中的抗體假陽性可能會夸大實(shí)際暴露和免疫的情況。尤其是在大范圍篩查的時候，隨著篩查基數(shù)的增加，假陽性結(jié)果的數(shù)量也會相當(dāng)可觀。

抗體測定容易受到內(nèi)源性干擾的影響而出現(xiàn)假陽性，包括類風(fēng)濕因子、異嗜性抗體和補(bǔ)體等，采用樣本稀釋、使用適當(dāng)?shù)淖钄鄤?、尿素解離等方法可以降低內(nèi)源性因素造成的假陽性。而外源性因素則需要評估與其他呼吸道病原體之間的交叉反應(yīng)，已有研究發(fā)現(xiàn)多個上市的抗體檢測試劑盒與多種呼吸道病毒間存在交叉反應(yīng)，如副流感病毒-4、人偏肺病毒、鼻病毒、腸道病毒以及冠狀病毒CoV-229E、CoV-NL63和CoV-OC43。Cheng等也發(fā)現(xiàn)檢測SARS-CoV-2抗體時與巨細(xì)胞病毒抗體和自身免疫抗體之間存在交叉反應(yīng)，通過優(yōu)化靶抗原的設(shè)計和生產(chǎn)過程，可以降低外源性因素造成的假陽性。

三、結(jié)論

新冠肺炎疫情正在全球蔓延，快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗室檢測方法是及時發(fā)現(xiàn)感染者的重要手段，也是防止SARS-CoV-2傳播的關(guān)鍵，動態(tài)血清學(xué)抗體檢測可與PCR核酸檢測聯(lián)合，相互補(bǔ)充，共同用于疑似患者的確診和排除診斷。在潛伏期和感染早期，由于窗口期的原因血清學(xué)檢測敏感性較低，因此應(yīng)采用核酸檢測；在感染的中期核酸檢測和血清學(xué)檢測對診斷均有價值；而在恢復(fù)階段，可以通過血清學(xué)檢測來確定患者感染和恢復(fù)情況。

另外，鑒于COVID-19疫情的持續(xù)播散所帶來的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，也需要進(jìn)行更廣泛的血清學(xué)檢測，以調(diào)查人群中的流行程度、各年齡組的感染程度、識別癥狀較輕或無癥狀的人群。SARS-CoV-2的血清學(xué)檢測目前正在加速發(fā)展，大量商業(yè)化試劑已上市或正在研發(fā)，但是仍需要更多的研究結(jié)果以評估抗體檢測的準(zhǔn)確性，并制定在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用策略。因為各種抗體檢測試劑盒有其獨(dú)特的特點(diǎn)，所以應(yīng)該針對本實(shí)驗室所用的檢測方法，建立血清轉(zhuǎn)陽時間的數(shù)據(jù)，并總結(jié)和分析假陰性和假陽性的可能情況，從而為臨床醫(yī)生的診治提供更有價值的參考。